3-3-5- آنزیم لاکتات دهیدروژناز بر حسب واحد در لیتر در بافت کبد………………………………………………..61
3-4- مقایسه یافته های سرمی…………………………………………………………………………………………………………………….63
3-4-1- آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز بر حسب واحد در لیتر در سرم……………………………………………………63
3-4-2- آنزیم آسپارتات آمینو ترانسفراز بر حسب واحد در لیتر در سرم………………………………………………65
3-4-3- آنزیم آلکالین فسفاتاز بر حسب واحد در لیتر در سرم………………………………………………………………67
3-4-4- آنزیم لاکتات دهیدروژناز بر حسب واحد در لیتر در سرم…………………………………………………………69
3-4-5- میانگین پروتئین کل بر حسب میلی گرم در دسی لیتر در سرم…………………………………………….71
3-4-6- میانگین غلظت آلبومین بر حسب میلی گرم در دسی لیتر در سرم…………………………………………73
3-4-7- میانگین غلظت گلوکز بر حسب میلی گرم در دسی لیتر در سرم……………………………………………75
3-4-8- میانگین غلظت تری گلیسیرید بر حسب میلی گرم در دسی لیتر در سرم……………………………..77
3-4-9- میانگین غلظت کلسترول بر حسب میلی گرم در دسی لیتر در سرم………………………………………79
3-4-10- میانگین غلظت بیلی روبین کل بر حسب میلی گرم بر دسی لیتر در سرم……………………………………81
فصل چهارم: بحث و نتیجه گیری
4-1- بحث
4-1-1- بررسی یافتههای بافتی
4-1-1-1- بررسی رسوب آهن در بافت کبد
4-1-1-2- بررسی یافتههای هیستوپاتولوژی
4-1-1-3- بررسی مقدار لیپید پراکسیداسیون در بافت کبد
4-1-1-4- بررسی مقدار آنزیم ها در بافت کبد
4-1-2- بررسی یافته های سرمی مربوط به عملکرد کبد
4-1-2-1- بررسی مقادیر آنزیم های سرم
4-1-2-2- بررسی میزان عملکردهای سنتتیک کبد
4-1-2-3- بررسی میزان عملکردهای دفعی و ترشحی کبد
4-2- نتیجه گیری
4-3- پیشنهادات برای مطالعات آینده
فصل پنجم: منابع
5-1- منابع انگلیسی
فهرست نمودارها
عنوان……………………………………………………………………………………………..صفحه
نمودار 3- 1- مقایسه میزان رسوب آهن در هپاتوسیتها………………………………………………………………………..49
نمودار 3- 2- مقایسه میزان آپوپتوز در هپاتوسیتها……………………………………………………………………………….49
نمودار 3- 3- مقایسه میزان التهاب و تورم در هپاتوسیتها…………………………………………………………………….50
نمودار 3- 4- مقایسه میزان تغییرات چربی در هپاتوسیتها…………………………………………………………………..50
نمودار 3- 5- مقایسه میزان اینفیلتراسیون در هپاتوسیتها……………………………………………………………………51
نمودار 3- 6- مقایسه میزان تغییرات وزن بدن در روزهای مختلف آزمایش……………………………………………52

نمودار 3- 7- مقایسه مقادیر تشکیل کمپلکس مالون دی الدهید در بافت کبد……………………………………..53
نمودار 3- 8- مقایسه مقادیر فعالیت آنزیم آلانین آمینوترانسفراز در بافت کبد………………………………………55
نمودار 3- 9- مقایسه مقادیر فعالیت آنزیم آسپارتات آمینوترانسفراز در بافت کبد……………………………….57
نمودار 3- 10- مقایسه مقادیر فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز در بافت کبد…………………………………………….59
نمودار 3- 11- مقایسه مقادیر فعالیت آنزیم لاکتات دهیدروژناز در بافت کبد………………………………………61
نمودار 3- 12- مقایسه مقادیر فعالیت آنزیم آلانین آمینوترانسفراز در سرم……………………………………………63
نمودار 3- 13- مقایسه مقادیر فعالیت آنزیم آسپارتات آمینوترانسفراز در سرم……………………………………..65
نمودار 3- 14- مقایسه مقادیر فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز در سرم……………………………………………………..67
نمودار 3- 15- مقایسه مقادیر فعالیت آنزیم لاکتات دهیدروژناز در سرم………………………………………………..69
نمودار 3- 16- مقایسه مقادیر پروتئین کل در سرم………………………………………………………………………………..71
نمودار 3- 17- مقایسه مقادیر گلوکز در سرم…………………………………………………………………………………………..73
نمودار 3- 18- مقایسه مقادیر کلسترول در سرم……………………………………………………………………………………..75
نمودار 3- 19- مقایسه مقادیر تری گلیسرید در سرم………………………………………………………………………………77
نمودار 3- 20- مقایسه مقادیر آلبومین در سرم……………………………………………………………………………………….79
نمودار 3- 21- مقایسه مقادیر بیلی روبین در سرم………………………………………………………………………………….81
فهرست تصاویر
عنوان……………………………………………………………………………………………..صفحه
تصویر 3- 1- بررسی هیستولوژیک کبد (رسوب آهن) در گروههای مختلف……………………………………………44
تصویر 3- 2- بررسی هیستولوژیک کبد (آپوپتوز هپاتوسیت) در گروههای مختلف……………………………..45
تصویر 3- 3- بررسی هیستولوژیک کبد (تورم) در گروههای مختلف………………………………………………………..46
تصویر 3- 4- بررسی هیستولوژیک کبد (تغییرات چربی) در گروههای مختلف………………………………………47
تصویر 3- 5- بررسی هیستولوژیک کبد (اینفیلتراسیون سلولهای التهابی) در گروههای مختلف……………48
فهرست شکلها
عنوان……………………………………………………………………………………………………………..صفحه
شکل 1- 1- هیستولوژی کبد………………………………………………………………………………………………………………………5
فصل اول
مقدمه
مقدمه و اهداف
بر اساس مطالعاتی که تا کنون صورت گرفته، مشخص شده که یکی از علل نارسایی حاد کبدی می تواند مصرف مقادیر زیاد آهن باشد که اغلب در کودکان زیر 6 سال و زنان باردار دیده می شود (Albertsen, 2006). آهن یکی از مهمترین عناصر موجود در بدن است که در هموگلوبین، میوگلوبین، سیتوکرومها و آنزیمهای وابسته به آهن یافت میشود. آهن توسط سلول ها به حالت تعادل بین سطح ضروری و سطح سمی آن حفظ می شود، در بعضی موقعیتها این تعادل به هم ریخته و باعث اضافه بار آهن1 می شود .( Sarkar et al., 2012) اضافه بار آهن میتواند سبب آسیب های مخربی به لوله گوارش شده، به زخم معده، خونریزی و شوک منجر گردد. آهن همچنین موجب افزایش نفوذپذیری مویرگها، اتساع آرتریولها و اسیدوز شدید می گردد. مکانیسم سلولی که توسط آن اضافه آهن منجر به سمیت میگردد شامل تشکیل رادیکالهای آزاد مثل رادیکال هیدروکسیل (·OH) طی واکنش فنتون و پس از آن شروع پراکسیداسیون لیپیدهای غشای اندامکها، اکسیداسیون پروتئین ها و نوکلئیک اسید است .(Zhang et al., 2006)پراکسیداسیون لیپیدها میتواند به تغییرات ساختاری و عملکردی در لیزوزومها، میتوکندری و شبکه اندوپلاسمی گردد. آسیبهای اکسیداتیو به غشای سلول و اندامکهایش میتواند کاهش قابل توجه در عمر سلولها را منجر شود (Allameh et al., 2008). رادیکالهای آزاد اکسیژن ناشی از مصرف بیش از حد آهن ممکن است نکروز کبدی را ایجاد میکنند که ابتدا نارسایی حاد کبدی و پس از آن نارسایی چندین اندام دیگر را به دنبال دارد(Sharma et al., 2011) . مطالعات نشان داده اند که سولفات آهن در شرایطی که بیش از حد معمول مصرف گردد، باعث سمیت کبدی میگردد که با نشت آنزیمهای کبدی هم در سرم و هم در بافت کبد و نیز افزایش میزان بیلیروبین در سطح سرم همراه است در حالیکه سطح پروتئینهای سرمی مثل آلبومین کاهش پیدا می کند. همچنین، مطالعات هیستولوژیک کبد حاکی از نکروز شدن هپاتوسیتها، تغییرات چربی و التهاب پورتال هستند ((Pawar et al., 2012. بیماری های کبدی با مرگ و میر زیادی همراه هستند، داروها و درمان های معمول تنها حدود ١۰ درصد از بیماران مبتلا را از مرگ نجات می دهد؛ همین موضوع سبب شده است تا برخی از دانشمندان علوم دارو شناسی پتانسیل فعالیت حفاظت کبدی را در گیاهان و بر پایه طب سنتی جستجو کنند (Selvi, 2012).
برای حفاظت از سلول های کبدی از داروهای شیمیایی گوناگونی بهره گرفته میشود. این داروها عملکرد کبد را تحت تاًثیر قرار میدهند اما استفاده از ترکیباتی آنتی اکسیدان و نیز گیاهان حاوی ترکیبات فنولیکی همچون کوئرستین، مفید بوده و اثر حفاظتی و بهبودی بخش خود را بدون اثرات جانبی میتوانند اعمال کنند (Satyendra et al, 2012).
فلاونوییدها2 متعلق به یک گروه از مواد طبیعی با ساختارهایی فنولیکی هستند که توزیع وسیعی در شاخه گیاهان دارند(Padma et al., 2012) . از میان بیوفلاونوییدهای آزمایش شده کوئرستین3 بالاترین خاصیت آنتی اکسیدانی را نشان داده است (Satyendra et al., 2012). کوئرستین با نام علمی ٣،٣،۵،۷،٣،۴-پنتاهیدروکسیل فلاوون4 یکی از برجسته ترین آنتی اکسیدان های رژیمغذایی است که در شکل گلیکوزیله خود در لوبیای سبز، کلم بروکلی، سیب، و مخصوصاً در پیاز یافت می شودHamed et al., 2012) ). گزارش شدهاست که کوئرستین دارای اثرات سودمند در سلامتی انسان است مثل حفاظت قلبی عروقی، فعالیت ضد سرطانی، فعالیت ضد ویروسی و ضد باکتریایی، و اثرات ضدالتهابی که این اثرات منجر به فعالیت و خواص آنتیاکسیدانی قوی آن می شود Satyendra et al., 2012)) .همچنین مشخص شده است که کوئرستین دارای اثرات درمانی در برابر بیماری های متعددی از قبیل نارسایی قلبی، آترواسکلروز، فیبروز کبدی، آسیب کلیوی، و جلوگیری از آسیب مزمن صفراوی استDavid et al., 2011) ). همچنین کوئرستین دارای اثرات سودمندی در سرکوب تکثیر سلول، حفاظت از اکسیداسیون لیپیدها و جلوگیری از تجمع پلاکتی می باشد Mishra et al., 2013)) .
از آنجایی که فلاونوئیدها مهارکننده های مؤثری در لیپیدپراکسیداسیون و کی لیت کردن آهن هستندGao et al., 1999) )، بنابراین جای تعجب نیست که فلاونوئیدها می توانند مهارکننده های خوبی برای فیبروز در بیماری اضافه بار آهن باشند. پس به طور خلاصه می توان گفت که مکمل های فلاونوییدی با هردو فعالیت آنتی اکسیدانی و کی لیت کردن آهن می تواند دفع آهن را در اضافه بار آهن در کبد موش افزایش داده و بنابراین کبد را ازاسترس اکسیداتیو و فیبروز حمایت کنند .(Zhang et al., 2006)
با توجه به مطالعات صورت گرفته مشخص شده است که کوئرستین دارای خواص ضدالتهابی، آنتی اکسیدانی و کی لیت کردن فلزات است؛ ولی تا کنون گزارشی مبنی بر بررسی اثر محافظتی آن در برابر اضافه بار سولفات آهن و تاثیر آن در نارسایی حاد کبدی و اختلالات عملکردی و بافتی کبد منتشر نگردیده است، از اینرو در این پژوهش این موضوع مورد بررسی و تحلیل قرار می گیرد.
1-2- کبد
1-2-1 – هیستولوژی کبد
کبد یکی از مهمترین اندامهای بدن است که البته بزرگترین غده هم به شمار میرود. این اندام چند لوبه و بزرگ است که در حفره شکم واقع شده و اعمالش در ارتباط نزدیکی با سیستم گوارشی است. (Guyton and Hall, 2006). این اندام 20% از خون خود را از شریان کبدی و80% مابقی را از ورید باب دریافت می کند. کبد توسط بافت همبند احاطه شده است و واحد اصلی عملکردی این اندام لوبول ها هستند که حول یک ورید مرکزی سازمان می یابند (Berne and Levy, 2008).
شکل ١-١- هیستولوژی کبد
هپاتوسیت ها یا سلول های پارانشیم کبدی جز ساختاری اصلی کبد هستند که 60% از کل سلول ها را تشکیل می دهند. آنها در هر لوبول به شکل شعاعی آرایش یافته اند و صفحات سلولی بین سینوزوئیدها (مویرگ های اختصاصی کبد) را تشکیل می دهند. خون از طریق انشعابات ورید باب و شریان کبدی به کبد وارد شده و پس از عبور از سینوزوئیدها به ورید مرکزی تخلیه می گردد (Vekemans and Braet, 2005). سینوزوئیدها عروق گشاد و نامنظمی هستند که از یک لایه سلول های اندوتلیال منفذدار منقطع تشکیل شده اند. زیر اندوتلیوم سینوزوئیدی و اندوتلیوم جدا کننده هپاتوسیت ها یک لایه نازک از بافت ارتباطی شل به نام فضای دیس وجود دارد که سلول های ستاره ای کبد در آن قرار گرفته اند (Berne and Levy, 2008).
1-2-2- عملکرد کبد
کبد مکان اصلی برای سوخت و ساز و دفع مواد زاید است و با تمام مسیرهای بیوشیمیایی رشد، مبارزه علیه بیماریها، تولید مواد مغذی، فراهم کردن انرژی و تولید مثل درگیر است (David et al., 2011). اعمال پنج گانه کبد عبارتند از: ١) کمک به متابولیسم کل بدن شامل متابولیسم کربوهیدرات ها، پروتئین ها، چربی ها، هورمون ها، و مواد شیمیایی خارجی ۲) سمیت زدایی، فیلتراسیون و ذخیره کردن خون ٣) دفع مواد زاید محلول در لیپید یا متصل به پروتئین ۴) ساخت پروتئینها، صفرا و عوامل انعقادی ۵) ذخیره ویتامین ها و آهنBerne and Levy, 2008) Guyton; and Hall,2006). این اندام هدف اصلی برای سمیت با آهن است به دلیل اینکه کبد عمدتاً مسئول برداشت و ذخیره مقادیر بیش از اندازه آهن است. تجمع بیش از حد آهن در کبد منجر به آسیبهای متعددی ازجمله نکروز سلولهای کبدی، التهاب، فیبروز و حتی سرطان می گردد (Zhang et al., 2006).
1-2-2-۱- ارزیابی عملکرد کبد
بیماری های کبدی اغلب با اختلالات بیوشیمیایی سیستم های مختلف کبدی یا عملکرد کبد منعکس می شوند. تست هایی که سطح آنزیم های سروم کبدی را اندازه می گیرند، به عنوان تست های عملکرد کبدی نشان داده می شوند و شامل آلانین ترانس آمیناز (ALT)، آسپارتات ترانس آمیناز (AST)، آلکالین فسفاتاز(ALP) ، گاماگلوتامیل ترانسفراز(GGT) ، زمان پروترومبین و آلبومین سرم هستند که آنها منعکس کننده عملکردهای مختلف کبدی می باشند (Giboney et al., 2005).
1-2-2-2- آمینوترانسفرازهای AST و ALT
ALT و AST قابل اطمینان ترین مارکرها برای آسیب کبدی و نکروز به حساب می آیند (Giannini et al., 2005). آمینوترانسفرازهای AST و ALTبا غلظت بالایی در کبد متمرکز هستند. سطح هردوی این آنزیم ها پس از آسیب هپاتوسیت ها، نکروز مرتبط با داروها، توکسین ها، ایسکمی و هپاتیت شدیداً بالا میرود (Giboney et al., 2005). AST علاوه بر سیتوزول در میتوکندری سلولهای کبدی و همچنین بافت های دیگر بدن از جمله قلب، ماهیچه اسکلتی، کلیه ها، مغز و گلبول های قرمز خون حضور دارد (Giannini et al., 2005). در حالیکه مقدار عمده ALT به طور طبیعی در کبد یافت می شود با این وجود در دیگر بافت های بدن از جمله کلیه ها و ماهیچه های اسکلتی هم یافت شده است (Giannini et al., 2005). بنابراین از آنجایی که در کبد ALT منحصراً در سیتوپلاسم سلول های کبدی است و غلظت آن در بافت های دیگر کم است، اینگونه انتظار می رود که افزایش سطح سرمی ALT برای آسیب کبدی اختصاصی تر باشد (Giboney et al., 2005).
١-۲-۲-٣- آلکالین فسفاتاز (ALP)
بیماری های کبدی و استخوانی شایعترین علل پاتولوژیکی بالا رفتن سطح این آنزیم می باشند. ALP عمدتاً از دو منبع سرچشمه می گیرد: مغز استخوان و کبد. این آنزیم ممکن است از بافت های دیگری همچون جفت، کلیه ها یا روده ها و یا از لکوسیت ها نشاَت بگیرد. این آنزیم مارکر غشای پلاسمایی و شبکه اندوپلاسمی به حساب می آید و اغلب برای بررسی یکپارچگی غشای پلاسمایی مورد ارزیابی قرار می گیرد (Giboney et al., 2005).
١-۲-۲-۴- لاکتات دهیدروژناز(LDH)
این آنزیم تقریباً در اکثر بافت های بدن حضور دارد و دارای پنج ایزوآنزیم مختلف می باشد (George et al., 1997). ایزو آنزیم های ١و۲ در بافت های قلب، کلیه، و گلبول های قرمز خون هستند در حالیکه ایزوآنزیم ٣ در بافت لنفاوی، ریه ها و پلاکت ها و بالاخره ایزوآنزیم های ۴و۵ در کبد حضور دارند (Faddah et al., 2007). وجود این آنزیم در سرم آسیب هپاتوسیت ها را مشخص می کند ، لیکن این آنزیم برای آسیب هپاتوسیت ها و نکروز آنها نسبت به آمینوترانسفرازها کمتر اختصاصی می باشد (Giannini et al.,2005). از آنجایی که ایزوآنزیم LDH در اندام ها و بافت های مختلف متفاوت است آنالیز آن در سرم در تعیین محل آسیب دیده سلولی مفید می باشد (George et al., 1997).
1-3- نارسایی حاد کبدی
1-3-1-تعریف
نارسایی حاد کبدی5 به القاء آسیب یا التهاب در بافت کبد منجرشده و یا با از بین رفتن سریع عملکرد سلول های کبد همراه می شود (Polson and Lee, 2005). نارسایی حاد کبدی که از نشانههای تشخیص آن Coagulopathy و Hepatic encephalopathy است، با نکروز حاد تعداد زیادی از هپاتوسیتها و یا به دنبال آسیب شدید عملکرد هپاتوسیتها به طور کاملاً ناگهانی ایجاد میشود (.(Stravitz and Kramer, 2009 در این حالت عملکردهای کبد مثل گلوکونئوژنز، تولید فاکتورهای انعقادی، عملکردهای دفعی کبد (ترشح صفراوی بیلیروبین و اسیدهای صفراوی) و عملکردهای متابولیکی آن (متابولیسم اوره) دچار اختلال میشوند (Gotthardt et al., 2007).
1-3-2- اتیولوژی
هپاتیت های ویروسی شایعترین علت قابل شناسایی نارسایی حاد کبد ((ALF در سراسر دنیا هستند. از دیگر علل شایع برای القاء نارسایی حاد کبدی را می توان عفونتها (هپاتوویروسها)، توکسینها (سم لیندان)، موادشیمیایی (تیواستامید، کلروکوین، فنوالریت و تتراکلریدکربن)، داروها (استامینوفن، سولفات آهن)، ایسکمی، هیپوکسی کبدی، مصرف الکل ، مواد مخدر ، اختلالات متابولیکی و اختلالات قلب عروقی را نام برد Polson and Lee, 2005)). داروهای مختلف هم از جمله دارو های ضد تشنج، عوامل ضد قارچی، عوامل ضد سل، هالوتان ها و کورتیکواستروئیدها، داروهای ضد التهابی غیراستروئیدی، بیماری ویلسون6 و سندرم ری7 هم منجر به نارسایی حاد کبدی می شوند (Gotthardt et al., 2007).
1-3-3- پاتوفیزیولوژی نارسایی حاد کبدی
به طور کلی نارسایی حاد کبدی با کاهش سنتز پارامترهای کبدی (اختلال شدید در عملکرد سنتتیک کبد) و کاهش سم زدایی که منجر به درجات مختلفی از انسفالوپاتی می شود، همراه است (Gotthardt et al., 2007). آسیب به هپاتوسیت ها، منجر به آسیب سلول یا مرگ سلول از طریق نکروز و آپوپتوز میشود (Rutherford and Chung, 2008). آسیب نکروزی سلول های کبدی هم به نوبه خود منجر به از دست رفتن یکپارچگی و تمامیت ساختاری غشای پلاسمایی و پارگی احتمالی آن و مرگ سلول با رهایش پروتئین های سیتوزولی از جمله لاکتات دهیدروژناز، آلانین آمینو ترانسفراز، آسپارتات آمینوترانسفراز، و فریتین شود (Smilkstein et al., 1988). که همگی منجر به افزایش حساسیت سلولی به آسیب های اکسیداتیو و اختلال در توانایی کبد در سم زدایی برخی از مواد سمی می شود؛ سایر مکانیسم های سم زدایی هم دچار اختلال می شوند: از جمله سیستم های حمل و نقل بیلی روبین که منجر به کلستاز8 و هیپربیلی روبینمیاا9 می گردند (Schilsky et al., 2009). یکی دیگر از ویژگی های مهم آسیب حاد و مزمن کبدی از دست رفتن کلی عملکرد کوپفر سل هاست که منجر به کاهش کلیرانس اندوتوکسین ها و دیگر موادی می شود که به طور منظم و مکرر توسط گردش خون به کبد وارد میشوند Hawker, 1997)).
١-٣-۴- پاسخهای التهابی کبد در ALF:
ماکروفاژهای مستقر در کبد یا کوپفرسلها نقش بارزی در فاگوسیتوز و ایمنی بازی میکنند. کوپفر سلها منبع اصلی پاسخهای التهابی در کبد میباشند و به محض تحریک، سیتوکینهای پیش التهابی مانند IL-6 و IL-1β را تولید میکنند (Colletti et al., 1996). در پاسخ به قرار گرفتن در معرض واسطههای التهابی وابسته به فعال شدن کوپفرسلها، هم سلولهای اندوتلیال و هم لکوسیتها فعال میشوند و لکوسیتها درون بافت کبدی تجمع پیدا میکنند و منجر به افزایش میزان التهاب و فاز ثانویه آسیب کبد میشوند (Vollmar and Menger., 2009).
واسطههای التهابی که منجر به تجمع لکوسیتها درون عروق کبدی میشوند عبارتند از: TNF-α، IL-8، IL-1α، فاکتورهای فعال کمپلمان و کموکاینهای CXC (Colletti et al., 1996). این واسطههای التهابی بیان لکوسیتی مولکولهای CD11b/CD18 (اعضای خانواده -2β اینتگرین پروتئینهای چسبنده) را افزایش میدهند و همچنین القای E-سلکتین، P-سلکتین و مولکول چسبنده داخل سلولی 10ICAM-1 را روی اندوتلیوم موجب میشوند، که باعث تجمع بیشتر لکوسیتها و در نهایت اختلال در خونرسانی به هپاتوسیتها و مرگ آنها میگردد. فعال شدن و تجمع لکوسیتها یک مکانیسم دفاعی به حساب میآید (Vollmar and Menger., 2009).
١-۴- منابع آهن در بدن
علاوه بر هموگلوبین خون، کبد بزرگترین منبع آهن به حساب میآید. این آهن به شکل فریتین در کبد یافت میشود. در هپاتوسیتهای کبدی میزان قابل توجهی از مولکول پروتئینی آپوفریتین وجود دارد که میتواند به طور برگشتپذیر با آهن ترکیب شود. بنابراین زمانی که غلظت آهن در مایعات بدن بالا رود با این مولکول ترکیب شده و فریتین را میسازد وتا وقتی که در نقطهای از بدن به آن نیاز نباشد از این مولکول آزاد نمیشود. از اینرو سیستم آپوفریتین-فریتین به عنوان بافر آهن خون و همچنین ذخیره کننده آهن عمل میکند (Guyton and hall, 2006).
١-۴-١- نقش آهن در ایجاد آسیب کبدی:
آهن یکی از مهمترین عناصر موجود در بدن است که در هموگلوبین، میوگلوبین، سیتوکرومها و آنزیمهای وابسته به آهن یافت میشود و در فرآیندهای سلولی و بیولوژیکی از قبیل سنتز هموگلوبین، حمل و نقل الکترون، سنتز DNA و همچنین رشد و تکثیر سلولها شرکت میکند. اگرچه یک سطح بهینه از آهن توسط سلول ها به حالت تعادل بین سطح ضروری و سطح سمی آن حفظ می شود، در بعضی موقعیتها این تعادل به هم ریخته و باعث اضافه بار آهن11 و سمیت کبدی می شود (Zhang et al., 2006). در شرایط پاتولوژیکی یا مرحله سمیت، اضافه بار آهن بافتهای مختلفی مخصوصاً کبد را تحت تأثیر قرار میدهد (Najafzadeh et al., 2010). از آنجایی که کبد محل اصلی ذخیره آهن به شمار میرود (2008Allameh et al., )، پیشنهاد شده است که غلظت خفیف تا متوسط آهن کبدی ممکن است آسیب کبدی را تشدید کرده و پیشرفت فیبروز کبدی را تسریع ببخشد (Arezzini et al., 2003).
سمیت با آهن به تولید رادیکالهای آزاد برمیگردد (McCord 1998). هم در شرایط نرمال و هم در شرایط پاتولوژیکی آنیون سوپراکسید (O_2^-) و هیدروژن پراکسید (H2O2) تولید میگردد که توسط آنزیمهای آنتیاکسیدانی بدن مثل سوپراکسید دیسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز و کاتالاز متابولیزه شده و این رادیکالهای آزاد را خنثی میکنند (Najafzadeh et al., 2010). یکی از اثرات آنیون سوپراکسید، رهایش آهن ذخیره شده از فریتین است. در حالت مصرف بیش از حد آهن، یونهای آزاد آهن با O_2^- و H2O2 طی واکنش فنتون12 واکنش داده و رادیکالهای سمیتر و واکنشپذیرتر هیدروکسیل (OH^•) را ایجاد میکنند.
Fenton reaction:
این رادیکال سمی هم به نوبه خود باعث دپلیمریزه کردن پلیساکاریدها، شکستن رشتههای DNA، غیرفعال کردن آنزیمها و شروع پراکسیداسیون لیپیدها میشود که به نوبه خود منجر به تخریب غشاهای سولی و غشاهای اندامکهای سلولی مثل میتوکندری و لیزوزوم میشود. به عنوان مثال با تخریب غشای لیزوزوم آنزیمهای پروتئولیتیک آزاد شده و آسیبهای بیشتری را به سلول اعمال میکنند و ممکن است مرگ سلول را موجب شوند (Hershko et al., 1998). آسیب با آهن می تواند با نشت آنزیمهایی مثل آلانین آمینوترانسفراز ALT))، آسپارتات امینوترانسفراز AST)) ولاکتات دی هیدروژناز (LDH) مورد ارزیابی قرار بگیرد Reddy et al., 1995)).

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

١-۴-۴- نارسایی حاد کبدی القاء شده توسط سولفات آهن:
سولفات آهن ارزانترین، سمی ترین وغالب ترین منبع استفاده آهن است که تقریبا 20% آن را عنصر آهن تشکیل می دهد. بروز علایم سمیت با آن ابتدا از لوله گوارش (با استفراغ خون به رنگ روشن) و اسهال شروع می شود و سپس با لکوسیتوز13 و اختلال در تنفس و حس همراه است که در نهایت به اسیدوز متابولیک و اغماء خاتمه مییابدAlbresten, 2006) ) .سولفات آهن با تجمع در سلولهای کوپفر و هپاتوسیتها همراه بوده و باعث برهم زدن ترتیب و آرایش هپاتوسیتها، هیپرتروفی در سلولهای کبدی و کاهش فضای سینوزوئیدی میشود .(Selvi., 2012; Padma et al., 2010)
١-۵- فلاونوئیدها
گیاهان با ترکیبات فنولیکی از قبیل فلاونوییدها14 یک نقش مهم در درمان تعدادی از بیماریها داشته و برخی از آنها یک اثر حفاظت کبدی قوی دارند Sharma et al., 2011)). فلاونوییدها دارای یک ساختار بنزوپیرن مشترک اند و آنها بر اساس ساختار سطحی به دلیل وجود یک پیوند دوگانه در مرکز حلقه آروماتیک و همچنین براساس میزان اشباع شدگی و شکافتگی حلقه مرکزی پیران عمدتاً به فلاون، فلاونول، ایزوفلاونول، فلاوانون، وفلاوانونولز دسته بندی میشوند (Padma et al., 2012; Hamed et al.,2011).
1-5-1- کوئرستین:
از میان بیوفلاونوییدهای آزمایش شده کوئرستین15 بالاترین خاصیت آنتی اکسیدانی را نشان دادهاست. کوئرستین با نام علمی 3,3,5,4 ,7-penta hydroxyl flavon)) یکی از برجسته ترین آنتی اکسیدان های پلی فنولیک رژیمغذایی است که در شکل گلیکوزیله خود در لوبیای سبز، کلم بروکلی، سیب، و مخصوصاً در پیاز یافت می شودHamed et al., 2012) ). شهرت این فلاونوئید به عنوان یک آنتی اکسیدان، از واکنش ترکیبات فنولی با گونه های رادیکال آزاد برای تشکیل رادیکال های فنوکسی که کمتر واکنش پذیر اند ریشه می گیرد(Padma et al., 2010).
١-۵-۲- اثرات حفاظتی کوئرستین بر کبد
اثرات سودبخش کوئرستین در نمونه های مختلفی از استرساکسیداتیو یافت شدهاست. کوئرستین از طریق بازگرداندن سطوح تغییریافته لیپیدها به حالت طبیعی، اثر حفاظتی در برابر تغییرات سطح لیپیدهای سرم و آسیب کبدی القاء شده با سم لیندان در رتهای ویستار اعمال می کند .( Padma et al., 2012)
مطالعات بر روی کبد موش صحرایی نشان داده اند که کوئرستین دارای اثرات آنتیاکسیدانی بر علیه آسیبهای استرس اکسیداتیو القاء شده با تیواستامید16 و کلروکوین17 (Mishra et al., 2013) و فنوالریت18 (Waheed et al., 2012) بوده و سطح آنتی اکسیدانهای کبد را بالا می برد. کوئرستین به عنوان یک فلز کیلاتور بسیار عالی شناخته شده است و ثابت شده که از طریق برهم کنش با متابولیت فعال و واکنشگر NAPQ1 حاصل از متابولیسم پاراستامول که به زنجیره تنفسی میتوکندری آسیب میرساند، از کاهش مصرف اکسیژن در زنجیره تنفسی میتوکندری جلوگیری به عمل آورده در نتیجه تنفس سلولی بعد از به کارگیری کوئرستین افزایش پیدا خواهد کرد، بنابراین از نکروزه شدن سلول ها جلوگیری به عمل می آورد (Guzy et al., 2004). IL-10یک سیتوکین ضدالتهابی قوی است که سنتز چندین واسطه پیش التهابی را کنترل می کند (Moore et al., 2001). گزارش ها حاکی از آن است که کوئرستین باعث جلوگیری از کاهش سطح سرمی آن در طی مصرف بیش از حد اتانول شده که مسئول عمل ضدالتهابی و کاهش آسیب در بافت کبد استChen 2010) ). همچنین کوئرستین منجر به پایین آوردن سطوح افزایش یافته سیتوکین های التهابی مثل IL-1β، IL-6 و IL-8 درسرم رت های مبتلا به بیماری کبد الکلی می شود (Chen 2010).
در سنتز اسیدهای چرب 19SREBP‑1c و FAS20 نقش دارند؛ ثابت شده است که کوئرستین بیان FAS و SREBP-1c را مهار کرده و با این کار از اثری که این پروتئین ها بر روی سنتز آنزیم های درگیر در بیوسنتز اسیدهای چرب در حالت بیماری کبد چرب غیر الکلی می گذارند ممانعت به عمل می آورد (Li et al., 2012). کوئرستین باعث سرکوب رهایش فاکتور هسته ای NF-кB با ممانعت از تخریب IкBα (کمپلکس پروتئینی مهار کننده NF-кB) می شود و در این صورت از اثری که این فاکتور بعد از ورودش به هسته و فعال کردن ژن های مسئول تولید فاکتور های دخیل در پاسخ های التهابی سلول می گذارد، ممانعت به عمل می آورد (Evans et al., 2002; Cho., 2003). فاکتور NF-кB از جمله مسیرهای سیگنالینگ حساس به استرس است که در شرایطی مثل افزایش تولید ROSو القای استرس اکسیداتیو در حالت مقاومت به انسولین و دیابت فعال می شود (Horton et al., 1998).
فصل دوم

مواد و روش ها
این تحقیق روی 35 سر موش صحرایی نژاد ویستار با وزن 300-250 گرم انجام شد. در ابتدای آزمایش موش های صحرایی در شرایط °c24-22 و سیکل روشنایی خاموشی 12 ساعت (هفت صبح تا 7 شب روشن و 7 شب تا 7 صبح تاریک) نگهداری می شدند. به جز در شرایط آزمایش، آب و غذا بصورت آزاد در اختیار آنها قرار می گرفت.
۲-۱- مواد مورد نیاز:
– موش صحرایی نر بالغ
– خوراک موش صحرایی
– آب مقطر
– پنبه و گاز
– کتامین و زایلازین
– تیوباربیتوریک اسید
– تری استو استیک اسید
– نیتروژن مایع
– فرمالین 10%
– کیت سنجش ALT، AST، ALP وLDH
– کیت سنجش بیلی روبین، آلبومین، گلوکز، کلسترول و تری گلیسیرید
– هماتوکسیلین
-ائوزین
-پارافین
– چسب انتلان
– کوئرستین
– سولفات آهن
۲-۲- وسایل مورد نیاز:
– میز جراحی
– وسایل جراحی (انواع قیچی و پنس)
– حمام آب
– PH متر
– ترازوی دیجیتال با دقت صدم گرم
– ترازوی مخصوص توزین موش
– میکروپیپت
– تانک ازت
– فریزر 80- درجه سانتیگراد (آزمایشگاه مرکزی)
– دستگاه میکروسانتریفیوژ (آزمایشگاه مرکزی)
– دستگاه اسپکتروفتومتر(آزمایشگاه مرکزی)
– میکروسکوپ نوری
– میکروسکوپ مجهز به دوربین عکاسی (اطاق تجهیزات میکروسکوپی)
– نیدل گاواژ مخصوص موش صحرایی
– یخچال فریزر

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب(به صورت کاملا تصادفی و به صورت نمونه) با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود-این مطالب صرفا برای دمو می باشد

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

– انکوباتور (آزمایشگاه تکوین)
– میکروتوم دوار (آزمایشگاه تکوین)
– سرنگ خونگیری
– اپندروف
– کرایوتیوب
– سرسمپلر
– جار رنگ آمیزی
– لام و لامل
– دستگاه هموژنایزر (آزمایشگاه مرکزی)
۲-٣- گروه های آزمایشی
پنج گروه از موشها مورد آزمایش قرار گرفتند (n=7) :
گروه شاهد (Sham): در این گروه تمامی مراحل آزمایش مطابق با پروتکل آزمایش انجام شد و به مدت 14 روز (روزی یک بار) یک میلی لیتر آب مقطر به صورت گاواژ به حیوانات داده شد.
گروه دریافت کننده حلال Sham+DMSO)): در این گروه تمام شرایط همانند گروه شاهد است با این تفاوت که تزریق درون صفاقی حلال کوئرستین (دی متیل سولفوکسید) به میزان یک میلی لیتر، به مدت 14 روز (روزی یک بار) دریافت شد.
گروه دریافت کننده کوئرستین (Sham+Q): در این گروه تزریق درون صفاقی کوئرستین به میزان 50 میلی گرم به ازاء هر کیلو گرم وزن بدن در یک میلی لیتر حلال (دی متیل سولفوکسید) به مدت 14 روز (روزی یک بار) صورت گرفت.
گروه دریافت کننده سولفات آهن (FS): در این گروه تمامی مراحل آزمایش مطابق با پروتکل آزمایش انجام گرفت و به مدت 14روز (روزی یک بار) تزریق درون صفاقی 30 میلی گرم به ازاء هر کیلو گرم وزن بدن سولفات آهن در یک میلی لیتر آب مقطر به حیوانات داده شد.
گروه دریافت کننده سولفات آهن + کوئرستین (FS+Q): در این گروه تمامی مراحل آزمایش مطابق با پروتکل آزمایش انجام شد و به مدت 14 روز (روزی یک بار) تزریق درون صفاقی 30 میلی گرم به ازاء هر کیلو گرم وزن بدن سولفات آهن در یک میلی لیتر آب مقطر به حیوانات صورت گرفت. در این گروه از روز چهارم تزریق درون صفاقی کوئرستین به میزان 50 میلی گرم به ازاء هر کیلو گرم وزن بدن در یک میلی لیتر حلال (دی متیل سولفوکسید) به مدت 11 روز (روزی یک بار) انجام شد.
۲-۴- روش آماده سازی حیوانات
بعد از اتمام 14 روز حیوانات با کتامین-زایلازین بیهوش شدند و پس از ثابت کردن آن ها بر روی میز جراحی، یک برش طولی بر روی شکم آن ها ایجاد می شد و با باز شدن آن، نمونههای خون از بطن قلبشان با استفاده از سرنگ گرفته شد و پس از گذشت چند دقیقه، سرم خون توسط دستگاه سانتریفیوژ مدل () جدا سازی و جهت اندازهگیری پارامترهای مختلف در دمای 20- درجه سانتی گراد، نگهداری شد. در پایان بافت کبد حیوان جدا و توزین شد. به منظور اندازه گیری میزان لیپید پراکسیداسیون و سنجش آنزیمهای موجود در بافت کبد سریعاً بخش های مشخصی از کبد بر روی یخ خشک جدا شده و در نیتروژن مایع در دمای ℃80- نگهداری شد. سپس بخش مشخصی از کبد جهت مطالعات هیستوپاتولوژی جدا و در فرمالین 10% تثبیت گردید.
۲-۵- سنجش میزان فعالیت آنزیمهای ALT، AST، ALP و LDH در سرم و بافت کبد:
تعیین میزان فعالیت آنزیمهای ALT، AST، ALP و LDH موجود در سرم و بافت کبد، با استفاده از کیت سنجش آنزیم ساخت شرکت پارس آزمون انجام گرفت.
به منظور آمادهسازی بافت برای اندازهگیری آنزیم، ابتدا بافت مورد نظر در یک میلی لیتر از بافر سیترات با PH= 4/8 هموژنه گردید. پس از سانتریفیوژ نمودن نمونه، محلول فوقانی موجود در اپندورف جهت سنجش فعالیت آنزیمها مورد استفاده قرار گرفت. در نمونه های خونی نیز، فعالیت آنزیم ها در سروم خون سنجش و اندازه گیری شدند.
نحوه تهیه محلول بافر سیترات با PH=4/8
استاک A (0/1 M سیترات سدیم با MW=294/10)
استاک B (0/1 M اسید کلریدریک با MW= 36/46)
بافر سیترات با PH=4/8: با مخلوط کردن 1 میلی لیتر استاک A و 2/9 میلی لیتر استاک B، تهیه میشود.
۲-۵-١- اندازه گیری آنزیمها بر اساس کیت:
برای اندازهگیری، از روش دومحلوله استفاده شد. در این روش، میزان مشخصی از نمونه با معرف شماره یک مخلوط شد. پس از 5 دقیقه انکوبه شدن در دمای ℃37 معرف شماره دو اضافه گردید. در نهایت پس از مخلوط شدن نمونه با معرف های یک و دو، مقدار جذب نوری در دقایق 1، 2 و 3 با استفاده از اسپکتروفتومتر (مدلDTS.7333) خوانده شد و طبق فرمول میزان هر آنزیم، محاسبه گردید.
محاسبه آنزیم ALT: نحوه محاسبه این آنزیم بدین صورت است که ابتدا نمونه l)µ 100( با معرف اول (lµ 1000) ترکیب شده و پس از مخلوط نمودن، 5 دقیقه در 37 درجه انکوبه و سپس معرف شماره دوم (lµ 250) اضافه میگردید. پس از مخلوط کردن، مقدار جذب نوری را بعد از 1 دقیقه در طول موج 340 نانومتر خوانده شده و بلافاصله کرونومتر را بکار انداخته و دقیقاً پس از 1، 2 و 3 دقیقه، اختلاف جذب نوری از دقیقه قبل تعیین گردید. در نهایت مقدار اختلافات جذب نوری پس از دقایق ١، ۲و ٣ با هم جمع و بر عدد ٣ تقسیم و میانگین بدست آمده در عدد ١٩۸۵ ضرب گردید.
محاسبه آنزیم AST: نحوه محاسبه این آنزیم در روشی کاملاً مشابه به آنزیم ALT انجام میگیرد.
محاسبه آنزیم ALP: نحوه محاسبه این آنزیم بدین صورت است که ابتدا نمونه l)µ 20( با معرف اول (lµ 1000) ترکیب شده و پس از مخلوط نمودن، 1 دقیقه در 37 درجه انکوبه و سپس معرف شماره دوم (lµ 250) اضافه میگردید. پس از مخلوط کردن، مقدار جذب نوری را بعد از 1 دقیقه در طول موج 405 نانومتر خوانده شده و بلافاصله کرونومتر را بکار انداخته و دقیقاً پس از 1، 2 و 3 دقیقه، اختلاف جذب نوری از دقیقه قبل تعیین گردید. در نهایت مقدار اختلافات جذب نوری پس از دقایق ١، ۲و ٣ با هم جمع و بر عدد ٣ تقسیم و میانگین بدست آمده در عدد 3433 ضرب گردید.
محاسبه آنزیم LDH: نحوه محاسبه این آنزیم بدین صورت است که ابتدا نمونه l)µ 10( با معرف اول (lµ 1000) ترکیب شده و پس از مخلوط نمودن، 1 تا 5 دقیقه در 37 درجه انکوبه و سپس معرف شماره دوم (lµ 250) اضافه میگردید. پس از مخلوط کردن، مقدار جذب نوری را بعد از 1 دقیقه در طول موج 340 نانومتر خوانده شده و بلافاصله کرونومتر را بکار انداخته و دقیقاً پس از 1، 2 و 3 دقیقه، اختلاف جذب نوری از دقیقه قبل تعیین گردید. در نهایت مقدار اختلافات جذب نوری پس از دقایق ١، ۲و ٣ با هم جمع و بر عدد ٣ تقسیم و میانگین بدست آمده در عدد 20000 ضرب گردید.
2-6- سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشای سلولهای کبد:
نحوه تهیه معرف آزمایش: 0/5 گرم تیوباربیتوریک اسید ((TBA در تری کلرو استیک اسید ((TCA ۲۰% رقیق گردیده و به حجم 100 میلی لیتر رسانده شد.
سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشای سلولهای کبد طبق روش ارائه شده توسط Heath و همکارش بر اساس تشکیل کمپلکس مالون دی آلدهید صورت گرفت (Heath and packer, 1986). 0/1 گرم از نمونه بافت کبد وزن گردید و همراه 5 میلی لیتر تری کلرو استیک اسید هموژنیزه شد. سوپرناتانت بدست آمده به مدت 10 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس 1 میلی لیتر از محلول شفاف رویی به لوله آزمایش منتقل گردیده و 1/5 میلی لیتر از معرف به آن اضافه شد. لولههای آزمایش در حمام آب با دمای جوش قرار داده شدند و پس از 30 دقیقه به ظرف یخ منتقل گردیدند.
مقدار تشکیل کمپلکس مالون دی آلدهید (TBA-MDA) با اندازهگیری جذب محلولها در طول موج 532 نانومتر مشخص شد. از آنجاییکه بعضی ترکیبات بعنوان مواد مزاحم عمل مینمایند، جذب را در 600 نانومتر خوانده و از جذب خوانده شده در طول موج 532 نانومتر کسر گردید. غلظت کمپلکس TBA-MDA با استفاده از ضریب خاموشی = 1/56×105ε و معادله زیر محاسبه شد:
A=εbc
در این معادله، A میزان جذب خوانده شده، ε ضریب خاموشی، b عرض کووت بر حسب سانتی متر و c غلظت کمپلکس میباشد که بر حسب مول بر گرم وزن تر محاسبه گردید.
۲-7- بررسی هیستوپاتولوژی کبد
جهت مطالعات هیستوپاتولوژی، قطعهای از لوب بزرگ با دقت جدا و در محلول فرمالین 10% نگهداری شد. این بافر به صورت زیر تهیه گردید:
مراحل مختلف پاساژ بافتی برای تهیه بلوکهای پارافینی از بافت مورد نظر که در این تحقیق بصورت دستی صورت گرفت به شرح زیر میباشد (Bancroft and Stevens, 1990).
1-آب گیری (Dehydration)
آب گیری به خارج کردن کامل آب بافت به کمک مواد شیمیایی گفته می شود. این کار با استفاده از عبور بافتها از ظروف حاوی الکل صورت میگیرد. چون در صورت خروج سریع آب از بافت، نمونه دچار چروکیدگی میگردد پس برای جلوگیری از این حالت از محلولهای الکلی با درصدهای کم شروع کرده تا به الکل مطلق 100% برسد. محلولهای الکلی به ترتیب با رقتهای 70%، 80%، 96% و 100% استفاده گردیدند.
2- شفاف سازی (Clearing)
بعد از آبگیری کامل بافت از یک محلول واسطه به علت غیر قابل حل بودن پارافین در الکل و جهت شفاف سازی استفاده میشود. رایج ترین محلولهای مورد استفاده، گزیلول میباشد. برای اطمینان از خروج کامل الکل از 2 ظرف حاوی گزیلول استفاده گردید.


پاسخ دهید