1-6-2-4-3-2- استفاده از میکروسکوپ نوری وفلورسانس………………………………………………………………..25
1-7- منشاء آسیب DNA اسپرم…………………………………………………………………………………………………………26
1-7-1- بسته بندی غیرطبیعی کروماتین……………………………………………………………………………………………27
1-8- ساختار کروماتین اسپرم و تأثیر آن بر ناباروری …………………………………………………………………………28
1-8-1- بررسی ساختار کروماتین اسپرم……………………………………………………………………………………………..28
1-9- نقش آپوپتوز در آسیب DNA اسپرم………………………………………………………………………………………..29
1-10- استرس اکسیداتیو به واسطه ROS…………………………………………………………………………………………30
1-11- تاثیر عوامل محیطی برسلامت DNA و میزان موفقیت روشهای کمک باروری…………………..31
1-11-1- مصرف سیگار………………………………………………………………………………………………………………………..31
1-11-2- مواجهات شغلی…………………………………………………………………………………………………………………….32
1-11-3- داروهای شیمی درمانی و رادیوتراپی……………………………………………………………………………………33
1-11-4- سن………………………………………………………………………………………………………………………………………..33
1-12- تکنیکهای بررسی ساختار کروماتین……………………………………………………………………………………….33
1-12-1- روشهای تعیین آسیب DNA اسپرم انسان………………………………………………………………………34
1-12-1-1- تست TUNEL……………………………………………………………………………………………………………….35
1-12-1-2- روش DBD-FISH………………………………………………………………………………………………………..35
1-12-1-3- روش Comet…………………………………………………………………………………………………………………..36
1-12-1-4- رنگآمیزی CMA3…………………………………………………………………………………………………………36
1-12-1-5- تکنیک SCSA………………………………………………………………………………………………………………..37
1-12-1-6- تست SCD……………………………………………………………………………………………………………………..37
1-12-1-7- رنگآمیزی آکریدین اورانژ………………………………………………………………………………………………..39
1-12-1-8- رنگآمیزی تولوئیدین بلو………………………………………………………………………………………………….39
1-13- روش مهاجرت اسپرم………………………………………………………………………………………………………………….39
1-14- روش سانتریفیوژ شیب غلظت…………………………………………………………………………………………………….40
فصل دوم- مواد و روش ها………………………………………………………………………………………………………………………41
2-1- مواد و وسایل مورد نیاز…………………………………………………………………………………………………………………42
2-1-1- وسایل مورد نیاز………………………………………………………………………………………………………………………….42
2-1-2- مواد مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………………………..42
2-2- ساخت محلول های مورد نیاز…………………………………………………………………………………………………………45
2-2-1- ساخت محلول Ham’s F10…………………………………………………………………………………………………….45
2-2-2- محلول های لازم برای تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)…………………………………………..46
2-2-3- ساخت محلول تانل……………………………………………………………………………………………………………………..46
2-2-4- ساخت محلول (PBS)……………………………………………………………………………………………………………….46
2-2-5- ساخت رنگ ائوزین-نیگروزین…………………………………………………………………………………………………….47
2-2-6- ساخت رنگ رایت………………………………………………………………………………………………………………………..47
2-3- روشها………………………………………………………………………………………………………………………………………………..48
2-3-1- روش جمع آوری اسپرم…………………………………………………………………………………………………………….. 48
2-3-2- آنالیز مایع انزالی………………………………………………………………………………………………………………………… 48
2-3-2-1- آزمایشات ماکروسکوپی…………………………………………………………………………………………………………..48
2-3-2-1-1- ظاهر………………………………………………………………………………………………………………………………….48
2-3-2-1-2- آبکی کردن…………………………………………………………………………………………………………………………48
2-3-2-1-3- حجم………………………………………………………………………………………………………………………………….48
2-3-2-1-4- چسبندگی…………………………………………………………………………………………………………………………48
2-3-2-2- آزمایشات میکروسکوپی………………………………………………………………………………………………………….49
2-3-2-2-1- آگلوتیناسیون……………………………………………………………………………………………………………………..50
2-3-2-2-2- بررسی تعداد اسپرم…………………………………………………………………………………………………………..50
2-3-2-2-2-1- روش استفاده از MAKLER CHAMBER برای شمارش ………………………………………..50

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

2-3-2-2-3- ارزیابی تحرک……………………………………………………………………………………………………………………51
2-3-2-2-3-1- روش کار……………………………………………………………………………………………………………………….52
2-3-2-2-4- ارزیابی قابلیت حیات…………………………………………………………………………………………………………53
2-3-2-2-4-1- روش کار رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین………………………………………………………………………53
2-3-2-2-5- ارزیابی مورفولوژی………………………………………………………………………………………………………………54
2-3-2-2-5-1- رنگ آمیزی پاپانیکولا……………………………………………………………………………………………………54
2-3-2-2-5-2- روش فیکس کردن………………………………………………………………………………………………………..54
2-3-2-2-5-3-روش رنگ آمیزی پاپانیکولا……………………………………………………………………………………………55
2-3-3- Direct swim-up………………………………………………………………………………………………………………………57
2-3-3-1- روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………….57
2-3-4- تست بررسی میزان پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)……………………………………………………………58
2-3-4-1- روش کار…………………………………………………………………………………………………………………………………58
2-3-5- روش رنگ آمیزی تانل…………………………………………………………………………………………………………………60
2-3-6- آنالیز آماری………………………………………………………………………………………………………………………………….62
فصل سوم- نتایج………………………………………………………………………………………………………………………………………..63
3-1 نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی تحرک اسپرم………………………………64
3-2- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قابلیت حیات اسپرم………………….67
3-3- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی مورفولوژی اسپرم……………………..68
3-4- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….70
3-5- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم………………………………………………………………………………….72
3-6- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی آپوپتوز اسپرم………………………………………………………………………………………………………………75
3-7- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم……………………………………78
3-8- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم…………………………………………………………………..79
3-9- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با میزان آپوپتوز اسپرم…………………………………………..80
3-10- نتایج کلی……………………………………………………………………………………………………………………………………80
فصل چهارم- بحث………………………………………………………………………………………………………………………………….81
4-1- تا ثیر روش آماده سازی Dricct Swim up بر روی پارامترهای اسپرم………………………………………83
4-2- تاثیر زمان های مختلف انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد بر روی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم…………………………………………………………………………………………………………………..84
4-3- پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………….90
منابع
چکیده انگلیسی
فهرست شکل ها
عنوان صحنه
1-1- ساختار اسپرم انسانی……………………………………………………………………………………………………………………..9
1-2- ارزیابی آسیب DNA توسط: …………..…………….…A.TUNEL, B.COMET, C.CMA337
1-3- تست SCD………………………………………………………………………………………………………………………………….38
2-1- انواع مختلف آگلوتیناسیون…………………………………………………………………………………………………………..50
2-2- MAKLER CHAMBERبرای شمارش اسپرم استفاده می شود………………………………………………51
2 -3- شکل لامل MAKLER CHAMBER …………………………………………………………………………………….52
2-4- چگونگی قرارگیری لوله فالکون بازاویه 45 درجه در انکوباتور…………………………………………………….57
3-1- رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین برای سنجش میزان زنده یا مرده بودن اسپرم…………………………….67
3-2- رنگ آمیزی پاپانیکولا ………………………………………………………………………………………………………………….69
3-3- تست SCD برای بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم میباشد……………………………………74
3-4- رنگ آمیزی TUNEL………………………………………………………………………………………………………………….76
فهرست جدول ها
عنوان صفحه
1-1 : خصوصیات میکرسکوپی نمونه انزال طبیعی مطابق با استاندارد های سازمان بهداشت جهانی (2010/WHO)…………………………………………………………………………………………………………………………………….17
2-1- ساخت Ham’sf10……………………………………………………………………………………………………………………..45
2-2- محلول های لازم برای رنگ آمیزی پاپانیکولا………………………………………………………………………………55
3-1-مقایسه پارامترهای اسپرمی قبل و بعد از آماده سازی اسپرم ……………………………………………………..71
3-2-مقایسه میانگین اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA آپوپتوز اسپرم……………………………………..77
3-3-مقایسه مقدار P اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم…………………………………..77
3-4- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم……………………………………78
3-5- رابطه میزان آپوپتوز اسپرم با سایر پارامترهای اسپرم………………………………………………………………….79
فهرست نمودارها

عنوان صفحه
3-1- مقایسه میانگین حرکت پیشرونده، حرکت سریع و حرکت کند قبل و بعد از آماده سازی اسپرم به روش Swim-up……………………………………………………………………………………………………………………………….66
3-2- مقایسه میانگین قابلیت حیات و مورفولوژی اسپرم قبل و بعد از آماده سازی به روش Swim-up…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..68
3-3- مقایسه میانگین حرکت پیشرونده و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم قبل و بعد از آماده سازی به روش Swim-up………………………………………………………………………………………………………………………………..70
3-4- مقایسه میانگین قطعه قطعه شدن DNA اسپرم در زمان های مختلف انکوباسیون بعد از آماده سازی به روش Swim-up…………………………………………………………………………………………………………………..73
3-5- مقایسه میانگین آپوپتوز اسپرم در زمان های مختلف انکوباسیون بعد از آماده سازی به روش Swim-up……………………………………………………………………………………………………………………………………………76
فصل اول
مقدمه
1-1- روش های کمک باروری
امروزه استفاده از روش های کمک باروری (1ART) بهترین گزینه برای رفع مشکلات زوج های نابارور است. میزان موفقیت این روش ها به عوامل متعددی از جمله سلامت کامل تخمک و اسپرم بستگی دارد. در این میان سلامت ژنوم پدری اهمیت زیادی در میزان پتانسیل باروری زوج ها دارد. بنابراین آسیب DNA اسپرم یک اختلال ژنومی است که به میزان متفاوت در مردان نابارور وجود دارد. از زمانی که اولین گزارش در مورد آسیب DNA اسپرم منتشر شد مطالعات وسیعی در این زمینه انجام گرفته و مشخص شده که در افراد دارای میزان بالای آسیب DNA، پارامترهای اسپرمی پایین می آید و قدرت باروری نیزکاهش می یابد.
از سالها پیش، استفاده از جراحی برای رفع نقایص ساختمان دستگاه تولید مثل، استفاده از داروهای باروری برای تحریک تخمکگذاری و روش IUI2 (انتقال اسپرم متحرک و شسته شده به رحم) از جمله روشهای رایج درمانی بوده و هستند. لیکن این اقدامات تنها برای گروهی از زوجهای نابارور مؤثر است. این در حالی است که روشهای جدیدی از جمله IVF 3 و ICSI 4 امروزه به عنوان گزینههایی مناسب در درمان سایر زوجین نابارور مطرح است.
میزان موفقیتART به سلامت و بلوغ گامت های زوجین وابسته است . طی لقاح طبیعی و روش لقاح آزمایشگاهیIVF احتمال نفوذ اسپرماتوزوای غیربالغ و ناسالم به داخل تخمک توسط سد زوناپلوسیدا به حداقل می رسد در صورتی که در روش میکرواینجکشن یا تزریق مستقیم اسپرم به داخل سیتوپلاسم تخمک ICSI این سد وجود نداشته و ایمن بودن روش ICSI همیشه مورد نگرانی بوده است . در ضمن تحقیقات نشان داده است که انتخاب اسپرم با پارامترهای معمولی (غلظت، مورفولوژی، تحرک ) نمی تواند گویای سلامت DNA اسپرم باشد(EI, MI, López-Fernández, Fernández, & Gosálvez, 2007). به تازگی لوئیس و سیمون (2010) اظهار داشتند که هیچ همبستگی بین پارامتر های معمولی اسپرم و آسیب DNA وجود ندارد(S. E. M. Lewis & Simon, 2010).
یکی از روش های کمک باروری روش تلقیح داخل رحمی (IUI) می باشد. که در این روش مایع انزالی از شوهر گرفته می شود و پس از عمل شستشو و جداسازی ، اسپرم های مرده و بدون تحرک از اسپرم های زنده و دارای تحرک جدا می شوند، سپس اسپرم های زنده و متحرک به وسیله کاتتر توسط متخصص، وارد حفره رحم می گردد.
در آزمایشگاه های ART، بعد از عمل شستشو و جداسازی معمولاَ به بررسی پارامترهای اسپرم که شامل تعداد، میزان تحرک و وضیعت مورفولوژیکی اسپرم و درصد زنده بودن می باشد، می پردازند اما به بررسی پارامترهای درون سلولی که شامل آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم است پرداخته نمی شود. همچنین در آزمایشگاه های ART معمولاَ انجام روش IUI از 5/0 تا حداکثر 3 ساعت بعد از عمل جداسازی و شستشو اسپرم انجام می دهند و در بعضی از مراکز درمان ناباروری بدون توجه به زمان، عمل تلقیح را انجام می دهند. با توجه به نقش اسپرم در پروسه لقاح در روش IUI، لازم است که علاوه بر توجه به ساختار سلولی اسپرم به بهترین زمان ممکن جهت انجام تزریق اسپرم آماده شده به داخل حفره رحمی توجه شود. لذا با مطالعه ساختار سلولی اسپرم و نیز تعیین زمان دقیق عمل تزریق اسپرم به داخل حفره رحمی می توان میزان لقاح و در نتیجه میزان حاملگی را افزایش داد.
یکی از عواملی که می تواند بر میزان موفقیت درمان زوج های نابارور و همچنین کیفیت گامت ها مهم باشد، کیفیت اسپرم است. در روش IUI بعد از جداسازی اسپرم از مایع منی و آماده سازی اسپرم برای انتقال، می تواند به خاطر انکوباسیون طولانی مدت، قطعه قطعه شدن DNA اسپرم افزایش پیدا کند(Muratori, et al., 2003).
مطالعات بیانگر این مطلب است که در تخمک های لقاح یافته با اسپرم های دارای آسیب بالای DNA، میزان لانه گزینی و بارداری به طور معنی داری کاهش می یابد . اگرچه ژنوم آسیب دیده پدری، طی رشد جنینی می تواند دستخوش پردازش قرار گیرد، ولی در صورت وجود آسیب های زیاد، احتمال کاهش رشد جنین وجود داشته و اگر میزان نقص ها کمتر باشد، می تواند نقایص بعد از تولد را به همراه داشته باشد. به همین دلیل، در دسته ای از بیماران، نوزادان متولد شده توسط روش ICSI دارای نقص ژنتیکی بیشتری نسبت به نوزادان طبیعی هستند .لازم به ذکر است که تحقیقات متعدد در این زمینه، نتایج ضد و نقیصی را گزارش کرده اند(Morris, Ilott, Dixon, & Brison, 2002).

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب(به صورت کاملا تصادفی و به صورت نمونه) با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود-این مطالب صرفا برای دمو می باشد

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

تجربیات به دست آمده از روش های کمک باروری نشان می دهد، چنانچه اسپرم با میزان بالایی از آسیب DNA، در روند IVF و ICSI وارد تخمک شود سیستم ترمیمی تخمک ممکن است توانایی ترمیم این آسیب ها را نداشته و در بسیاری از موارد با وجود موفقیت در لقاح، سلول های جنسی توانایی تشکیل جنین یا ادامه تکامل را تا مرحله بعد از 4 تا 8 سلولی که مصادف با فعال شدن ژنوم است، ندارند . براساس تحقیقات مشخص شده که توانایی ترمیم تخمک وابسته به سن مادر بوده و تخمک های افراد جوان، از قدرت ترمیم DNA بالایی برخوردارند . به علاوه تحقیقات متعدد در زمینه آسیب DNA بیانگر این هستند که ارتباط معنی داری بین آسیب DNA و میزان لقاح وجود ندارد ولی بین آسیب DNA اسپرم و تشکیل جنین، بلاستوسیت، رشد جنین و بارداری ارتباط معکوس و معنی داری وجود دارد(Morris, et al., 2002).
پس از آماده سازی اسپرم به طور معمول در 37 درجه سانتی گراد انکوبه می شود تا در ART از آن استفاده شود (Van der Westerlaken, Naaktgeboren, Verburg, Dieben, & Helmerhorst, 2006) ، ولی هنوز زمان بهینه برای انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد قبل از استفاده در ART وجود ندارد. بعضی از محققین سعی برای پیدا کردن اثر گذشت زمان بر پارامترهای اسپرم بعد از انکوبه کردن در دمای 37 درجه سانتی گراد را دارند. اثر انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد نشان داد که بعد از گذشت 24 ساعت می تواند بر روی تحرک و قابلیت حیات اسپرم تاثیر گذار باشد(Calamera, Fernandez, Buffone, Acosta, & Doncel, 2001).
بعد از آماده سازی اسپرم برای استفاده در تکنیک های ART انکوباسیون کوتاه مدت در دمای 37 درجه سانتی گراد می تواند باعث ظرفیت یابی اسپرم شود اما انکوباسیون طولانی مدت می تواند بر روی DNA اسپرم تاثیر داشته باشد(Marı́n-Briggiler, Tezón, Miranda, & Vazquez-Levin, 2002).
1-2- ناباروری5
ناباروری به معنای عدم توانایی برای بچه دار شدن، بعد از یکسال مقاربت بدون جلوگیری می باشد. حدود 15-10 درصد در سنین باروری خود، با این مشکل مواجه می باشند. عدم برخورد صحیح با مسئله ناباروری می تواند منجر به بروز مشکلات روحی، روانی و اجتماعی گردد. طیف وسیعی از عوامل زنانه و مردانه در ناباروری نقش دارند. حدود50 درصد موارد ناباروری مربوط به فاکتورهای مردانه است و تقریباً 15-10 درصد موارد ناباروری علت نا مشخص دارد. علل ناباروری مردان شامل طیف وسیعی از عوامل وراثتی، هورمونی، محیطی، فیزیولوژیک، مواد سمی و داروئی می باشد که سبب بروز علائمی چون عدم تولید اسپرم، تعداد بسیار کم یا کیفیت بد اسپرم های تولید شده می گردد(Agarwal & Said, 2003).
1-3- تولید اسپرم
تولید مثل جنسی شامل الحاق گامت نر و ماده است. منشاء مشترک اسپرم و تخمک، سلول های جنسی اولیه6 است. در انسان وسایر پستانداران، سلول های جنسی اولیه در حدود هفته پنجم جنینی از کیسه زرده مشتق می شوند و با مهاجرت خود از طریق آلانتوئیس به آندودرم روده خلفی رفته و به دنبال آن وارد مزانتر پشتی شده و در نوار های تناسلی موجود در سمت پشتی جنین جای می گیرند. طناب های جنسی در دوران جنینی شکل می گیرند، در جنس نر هنگام تولید این طناب ها توپر بوده و دارای دو نوع سلول جنسی و غیر جنسی می باشند. سلول های جنسی دارای هسته ای بزرگ و روشن به همراه یک یا چند هستک است که بزرگتر از سلول های غیر جنسی می باشند. این سلول ها که اسپرماتوگونی7 نوع A خوانده می شوند از تقسیمات میتوزی سلول های جنسی اولیه بوجود می آیند و بر روی غشاء پایه طناب های جنسی8 قرار دارند. سلول های غیر جنسی کوچک تر می باشند و در اوایل دوران جنینی تکثیر یافته و سلول های سرتولی9 (پشتیبان) را می سازند. با آغاز سن بلوغ، در پاسخ سیگنال های هیپو تالاموسی، سرعت تکثیر و تمایز این سلول ها بالا می رود و پس از مراحلی، به اسپرم بالغ تبدیل می شوند. مراحلی که موجب تکثیر سلول های اسپرماتوگونی، میوز و تغییرات مورفولوژیک آنها و در نهایت تبدیل اسپرماتوگونی به اسپرماتوزوئید می شود را اسپرماتوژنز10 گویند (Guyton & Hall, 2006).
1-4- مایع انزالی11
مایع انزالی انسان حاوی پلاسمای سمینال، اسپرماتوزوئید ها و ترکیبات دیگر می باشد. حجم آن در افراد متغییر است. پلاسمای سمینال از ترشحات غدد لیتر12، وزیکول سمینال، کوپر، پروستات، اپیدیدیم و آمپولا تشکیل شده است. در حین انزال اسپرم از انتهای اپیدیدیم و مجاری دفران با ترشحات غدد ضمائم جنسی مخلوط می شود.
ابتدا ترشحات غدد لیتر وکوپر، سپس ترشحات آمپول و اپیدیدیم تخلیه شده و سرانجام بخش اعظم مایع انزالی در انسان (حدود70 درصد) از ترشحات وزیکول سمینال حاوی مواد فعال کننده اسپرماتوزوئید ها مانند فروکتوز، سیترات، اینوزیتول، پروستاگلاندین ها و چندین پروتئین و تعدادی عناصر معدنی و مواد آلی می باشد. پلاسمای سمینال بخش اعظم سیمن انسان را تشکیل می دهد. ترکیبات پلاسمای سمینال ممکن است در انقباض بافت های مجرای دستگاه تولید مثل زن و در نتیجه تسهیل انتقال اسپرم موثر باشد. مایع سیمن دارای 5/7PH= است که علت آن ترشحات قلیائی پروستات است که علاوه بر خنثی کردن اسیدیته مختصر مایعات سیمن، خاصیت قلیائی مختصری به آن داده و باعث ظاهر شیری رنگ آن می شود. مایع پروستات همچنین دارای آنزیم منعقد کننده است که با اثر بر فیبرینوژن موجود در مایع سمینال وزیکول باعث شکل گیری لخته فیبرینی ضعیفی می شود که سیمن را در قسمت های عمقی واژن در مجاورت گردن رحم نگه می دارد و ظرف 30-15 دقیقه تحت تأثیر فیبرینولیزین حل می شود. هرچند نقش دقیقی برای پلاسمای سمینال شناخته نشده است ولی بعنوان محیطی برای انتقال اسپرم در دستگاه تناسلی مرد عمل می کند و همچنین شرایط قلیائی و غذائی برای زنده ماندن اسپرم در محیط اسیدی واژن فراهم می نماید(Guyton & Hall, 2006).
نمونه سیمن طبیعی ظرف 60-30 دقیقه در در جه حرارت اتاق به حالت محلول در می آید. در بعضی نمونه ها محلول شدن کامل در عرض 60 دقیقه اتفاق نمی افتد. وجود تکه های موکوس یک عامل مهم در این امر است. لوله سیمن نرمال حاوی تکه هایی شبیه ژله می باشند (اجسام ژلاتینور) که محلول، مایع نمی شود. علت این امر به طور کامل مشخص نیست. گاهی می توان به نمونه ای که مایع نمی شود موادی اضافه کرد مانند برومیلن یا پلاسمین که در این صورت برای آزمایش آماده می باشد.

1-4-1- آنالیز مایع انزالی
به علت عدم وجود یک تست آزمایشگاهی برای پیشگویی قطعی پتانسیل باروری در مردان، آنالیز مایع انزالی (SA13) اولین تست مورد استفاده برای پیش بینی قدرت باروری مردان می باشد. قبل از گرفتن نمونه انزال، به بیمار آموزش داده می شود تا از عمل انزال به مدت 3-2 روز پرهیز نماید. حجم مایع انزالی، غلظت اسپرم و تعداد اسپرم، به طور مداوم طی 10 روز پرهیز جنسی افزایش می یابد. انزال مکرر ممکن است همراه با کاهش حجم مایع انزالی و کاهش تعداد کلی اسپرم های متحرک باشد. در حالیکه انزال با دفعات کمتر، با کاهش اسپرم های دارای مورفولوژی طبیعی همراه بوده است(Nallella, Sharma, Aziz, & Agarwal, 2006). سازمان بهداشت جهانی (14WHO) استفاده از پروتکل استانداردی را جهت ارزیابی مایع سمینال پیشنهاد کرده و طبق این پروتکل، هر نمونه از نظر پارامترهای میکروسکوپی و ماکروسکوپی مورد ارزیابی قرار می گیرد. برای انجام آنالیز، نمونه انزال افراد معمولاً به روش خود انزالی15 جمع آوری می شود. این روش نمونه گیری نسبت به نمونه گیری سمین از طریق مقاربت فواید زیادی دارد از جمله می توان به اجتناب از تأثیر حرارت، تسریع در انجام و عدم آلودگی با ترشحات دستگاه تولید مثل زن اشاره کرد. حدود 15 درصد بیمارانی که از لحاظ پروتکل استاندارد WHO نرمال و دارای اسپر موگرام16 طبیعی هستند، یعنی مایع سیمن آن ها از لحاظ ماکروسکوپی (سیالیت، ظاهر، حجم، ویسکوزیته و PH) و میکروسکوپی (تعداد اسپرم، تحرک، آگلوتیناسیون، مورفولوژی، میزان زنده بودن و حضور یا عدم حضور سلول های غیر اسپرمی) نرمال است، دارای مشکل ناباروری می باشند و بالعکس در مردان با آنالیز سیمن غیر طبیعی، موارد باروری هم مشاهده شده است. بنابراین آنالیز مایع سیمن برای شناسائی دقیق نقایص اسپرمی موجود در بیماران با فاکتورهای نا باروری مردانه کافی نیست و انجام تست های تکمیلی ضروری می باشد(Nallella, et al., 2006).
1-1- ساختار اسپرم انسانی
1-5- پارامترهای اسپرم
1-5-1- مورفولوژی17
یکی از پارامترهای مهم آنالیز اسپرم مورفولوژی است (Ichimura, et al., 1995). در واقع استاندارد کردن مورفولوژی اسپرم روش بسیار مشکلی است، زیرا طیف مورفولوژی بسیار وسیع است. طبقه بندی های زیادی در زمینه مورفولوژی اسپرم انجام شده که کار دشواری است. زیرا هر کدام طیفی از طبقه بندی استاندارد را مشخص می کند، در زمینه مورفولوژی اسپرم دو سوال مهم مطرح می باشد :مورفولوژی نرمال کدام است؟ مورفولوژی غیر طبیعی چه تاثیری در قدرت باروری اسپرم دارد؟
تقسیم بندی قدیمی شکل طبیعی اسپرم را بیضی شکل معرفی می کند که دارای سر به ابعاد 5×5/2 میکرون است و حدود 70 درصد قدامی سر توسط آکروزوم یکنواخت پوشانده شده، در ضمن دارای گردن سالم و بدون نقائص آناتومیکی با دم دراز و کشیده می باشد. ولی تقسیم بندی Strict بر مبنای تعداد اسپرم موجود در موکوس کانال اندروسرویکس بعد از نزدیکی استوار است(Isachenko, Isachenko, Katkov, Dessole, & Nawroth, 2003). برخی محققین دسته ای از اسپرم های یکنواخت را در کانال اندروسرویکس یافتند که از نظر بیولوژی برای باروری انتخاب شده بودند. محدوده های مورفولوژی طبیعی با مقایسه ی این اسپرم ها با لقاح خارج رحمی مشخص شد. مورفولوژی فقط به عنوان یک اصل فرعی برای باروری تلقی می شود و یک عامل تعیین کننده ی باروری در مقابل ناباروری است.
تمامی نمونه های سیمن دارای در صد خاصی از اسپرم های غیر طبیعی هستند. ناهنجاری های مورفولوژیک ممکن است شامل ناهنجاری های سر، قطعه میانی و یا دم اسپرم باشند. ناهنجاری های سر اسپرم همراه با نازایی هستند. پیشنهاد کرده اند که مورفولوژی اسپرم ممکن است پیشگویی کننده لقاح موفقیت آمیز خارج رحمی باشد (McLaughlin, Ford, & Hull, 1992). مورفولوژی اسپرم با قدرت باروری ارتباط دارد. ارزیابی مورفولوژی اسپرم یک شاخص حساس کیفیت اسپرماتوژنز و باروری است. وجود نقایص مورفولوژیکی می تواند با فعالیت نرمال اسپرم مغایرت داشته باشد. این نقایص می تواند در جلوگیری از عبور اسپرم از موکوس سرویکس، باند شدن اسپرم با زوناپلوسیدا و واکنش آکروزومی نقش داشته باشد. گاهی افراد با تعداد طبیعی اسپرماتوزوئید نابارور می باشند. در چنین حالتی گاهی دیده می شود که تا 100 درصد اسپرم ها از نظر مورفولوژی غیر طبیعی هستند. مثلا: دو سر، سر غیر طبیعی و یا دم غیر طبیعی دارند. در موارد دیگر اسپرم از نظر ساختمانی کاملا طبیعی به نظر می رسد اما به دلایلی، کاملا بی حرکت یا نسبتا بی حرکت است. هر گاه قسمت اعظم اسپرماتوزئید ها از نظر شکل غیر طبیعی باشند و یا فاقد حرکت باشند با وجودی که اسپرماتوزوئیدها شخص طبیعی به نظر می رسند ولی احتمال ناباروری وجود دارد. بر اساس مطالعات اپیدمیولوژی کمترین حد مورفولوژی طبیعی اسپرم برای حاملگی طبیعی 30 درصد در نظر گرفته می شود. اسپرماتوزوئید پستانداران مختلف از نظر شکل ظاهری با هم متفاوت می باشند. در همه پستانداران، اسپرم از سه قسمت اصلی سر18، بخش میانی19 و دم20 تشکیل شده است. هر سه قسمت توسط غشای پلاسمایی پوشانده شده اند. غشا پلاسمایی ساختمان پوسته ای است که در انتقال مواد غذایی به داخل سلول نقش فعال دارند. قسمتی از غشای پلاسمایی که سطح قدامی سر اسپرم را می پوشاند در ارتباط با واکنش آکروزومی عمل می نماید. این عمل بعد از ظرفیت یابی و قبل از نفوذ به ناحیه شفاف اطراف تخمک صورت می گیرد(Hashemi, Karami‐Tehrani, Ghavami, Maddika, & Los, 2005). بخش عمده سر، حاوی هسته با کروموزم های هاپلوئید است. هر کروموزوم حاوی DNA است که با پروتئین های پروتامین پیچیده شده است. پروتامین نقش عمده ای در تراکم DNA اسپرم دارد. این متراکم شدن باعث کاهش حجم اسپرماتوزوئید جهت تسهیل انتقال در دستگاه تناسلی ماده و به حداقل رسیدن آسیب به DNA اسپرم می شود. دو سوم جلوی سر اسپرم دارای ساختمان کلاهک مانندی به نام آکروزوم است که از دستگاه گلژی مشتق می شود. آکروزوم دارای آنزیم های هیدرولیتیکی از جمله هیالورونیداز، اسید فسفاتاز و نورآمینیداز می باشد که برای انجام واکنش آکروزومی و جهت نفوذ اسپرم به پوشش خارجی محاط کننده دور تخمک ضروری است. بخش میانی اسپرم حاوی میتوکندری است که ATP 21 لازم برای حرکت دم و در نتیجه حرکت اسپرم و حفظ تعادل اسمزی را تولید می کند. در بخش دم که تاژک نامیده می شود، نیروی حرکتی لازم برای رسیدن اسپرم به تخمک و نفوذ به داخل زوناپلوسیدا22 را فراهم می کند. این تحرک ناشی از حرکات موجی شکل تاژک است که از انرژی بیوشیمیایی ATP حاصل می گردد و با تبدیل انرژی جنبشی باعث روی هم لغزیدن میکروتوبول های موجود در تاژک و تحرک اسپرم شود(Hashemi, et al., 2005).
1-5-2- تحرک23 اسپرم
یک پارامتر مهم در آنالیز مایع سیمن، تحرک اسپرم است که به صورت درصد اسپرم های دارای تحرک پیشرونده در مایع انزال تعریف می شود. تحرک پیشرونده، در واقع با محاسبه حرکت سریع (a) به اضافه حرکت کند (b) به دست می آید. تعداد کل اسپرم های متحرک، با محاسبه تحرک پیشرونده به اضافه حرکت غیر پیشرونده ( درجا) محاسبه می شود. WHO و اکثر آزمایشگا ه ها از تحرک 50 درصد بعنوان حد پایین طبیعی استفاده می کنند. با وجود این، انجمن تکنولوژی باروری، تحرک به میزان 40 درصد را به عنوان معیاری برای تعریف ناباروری ناشی از فاکتور مردانه قبول دارد. به این ترتیب حد پایین طبیعی، تغییرات بارزی را نشان می دهد و بستگی به تجربه آزمایشگاه منطقه دارد. بطور کلی مردان با تعداد اسپرم متحرک بیشتر از 10 میلیون در هر میلی لیتر، نسبت به آن هایی که 2 تا 10 میلیون اسپرم در هر میلی لیتر دارند، میزان باروری بالاتری دارند. تحرک اسپرم ناشی از حرکات موجی شکل تاژک است که از تبدیل انرژی بیوشیمیایی ATP به انرژی جنبشی ناشی می گردد و به سبب روی هم لغزیدن میکروتوبول های موجود در تاژک می شود. در اسپرماتوزوئیدهای انسان ناهنجاری های عناصر مختلف تاژک، باعث اختلال در تحرک می شود و بر اساس نقص در ساختمان آکسونم و یا پیش آکسونم24 تقسیم بندی می شود. حرکت نفوذی اسپرم برای عبور از موکوس گردن رحم و نفوذ به لایه شفاف تخمک ضروری به نظر می رسد.
اسپرم های حاصل از انزال دارای سرعت های مختلف بوده و تحت تاثیر فاکتورهای متعددی می باشند. مثلا اگر ویسکوزیته مایع سمینال زیاد باشد یا درجه حرارت محیط اسپرم کاهش یابد، تحرک اسپرم کاهش می یابد(Leist & Nicotera, 1998). رادیکال های آزاد اکسیژن (ROS25) می تواند با آسیب به ساختمان تاژک سبب کاهش تحرک اسپرم شوند یا مثلا واریکوسل باعث افزایش حرارت کیسه بیضه شده و سبب کاهش اسپرماتوژنز و تجمع ترکیبات فرعی متابولیک می شود که باعث کاهش بیشتر تحرک و افزایش مورفولوژی غیر عادی و کاهش عملکرد سلول های بینابینی می گردد(Agarwal & Said, 2003). با کمک روش های رنگ آمیزی مناسب مشخص شده که وجود اسپرم های غیر متحرک به مفهوم مرگ این سلول ها نمی باشد. بدنبال مقاربت، اسپرم ها را می توان بین 5/1-3دقیقه پس از انزال، در موکوس گردنه رحم جستجو کرد. و حدود دو ساعت پس از مقاربت اسپرماتوزوئیدها خود را به لوله رحم می رسانند.
کاهش تحرک اسپرم با عنوان آستنوزوسپرمیا26 خوانده می شود. این عارضه توسط عواملی ایجاد می شود که عبارتنداز : واریکوسل27، عدم انزال طولانی مدت، اختلال های بیوشیمیایی یا ساختمانی اجزای اسپرم و اپیدیدیم و آنتی بادی های ضد اسپرم(Kroemer, Petit, Zamzami, Vayssiere, & Mignotte, 1995). بسیاری از مراکز میزان تحرک اسپرم را طبقه بندی کرده اند که از بی تحرک تا حرکت سریع روبه جلو متغیر است. گرچه امروزه در آزمایشگاه های پیشرفته از تکنولوژی 28CASA برای بررسی کلنیکی حرکت اسپرم استفاده می کنند اما روش مرسوم ، بررسی میکروسکوپی در آزمایشگاه است.
1-5-3- درجه بندی تحرک اسپرم
سازمان بهداشت جهانی اسپرم ها را از نظر تحرک به 4 دسته تقسیم کرده است که شامل :
الف- حرکت سریع و پیشرونده در مسیر مستقیم (نوعa )29 : اگر اسپرمی چهار برابر اندازه سر به جلو حرکت کند ( حدود 25 میکرو متر در ثانیه) آن را دارای حرکت سریع می دانیم (اندازه سر اسپرم حدود 5-4 میکرون طول دارد).
ب- حرکت روبه جلو پیشرونده آهسته (نوعb)30: اگر اسپرم سریع از جلوی چشم ما دور نشود، یعنی حدود 15 میکرو متر در ثانیه حرکت داشته باشد دارای حرکت آهسته است.
ج- دارای تحرک اما بدون الگوی پیشرونده (نوع c)31 : اگر اسپرم، متحرک باشد ولی هیچگونه پیشرفتی به جلو نداشته باشد دارای حرکت درجا است.
د- فاقد تحرک (نوع d) : چنین اسپرمی ثابت است و هیچ حرکتی ندارد(Brotherton, 1990).
1-5-4- قابلیت حیات 32 اسپرم
قابلیت حیات اسپرم و میزان هیپواسمولاریتی، توسط ساختمان غشاء اسپرم و عملکرد آن تعیین می شود. اسپرم زنده با غشاء سالم اجازه عبور برخی رنگ ها مانند ائوزین و تریپان بلو را به داخل سیتوپلاسم نمی دهد. بنابراین در مقابل زمینه تاریک، سفید به نظر می رسد. اسپرمی که ساختمان غشای آن نقص داشته باشد، نمی تواند از نفوذ رنگ به داخل خود جلوگیری کند لذا سیتوپلاسم آن به رنگ صورتی یا آبی دیده می شود. بنابراین کل ساختمان غشایی به وسیله آزمایش قابلیت حیات اسپرم اندازه گیری می شود(S. Howell & S. Shalet, 2001; S. J. Howell & S. M. Shalet, 2001). اندازه گیری قابلیت حیات اسپرم مهم است، زیرا باعث جداسازی نمونه های نکرواسپرمیک از نمونه های اسپرم زنده ولی بدون تحرک می شود. قابلیت حیات اسپرم با میزان باروری ارتباط دارد(Botchan, et al., 1997). قابلیت حیات اسپرم ها معمولا در نمونه هایی که درصد اسپرم های بی تحرک در آن ها بیش از 50 درصد است انجام می شود (Sakkas, Mariethoz, & St John, 1999). بنابراین برای شناسایی اسپرم های زنده از مرده، در نمونه های آستنو اسپرمی که درصد اسپرم های بی تحرک بیش تر است از این تست استفاده می شود (Mahadevan & Trounson, 1983).
1-5-5- حجم 33
حجم نرمال مایع انزالی بر اساس معیار WHO بیشتر از 2 میلی لیتر می باشد و از فردی به فرد دیگر متغیر می باشد. اگر حجم انزال کمتر از 1 میلی لیتر باشد فرد هیپواسپرمی34 و اگر حجم انزال بیش از 6 میلی لیتر باشد، به آن هیپراسپرمی35 می گویند. غالبا حجم خیلی کم مایع سمینال (کمتر از 1 میلی لیتر) همراه با شمارش پایین و در حجم زیاد (بیش از 6 میلی لیتر)، تعداد اسپرماتوزوئیدها کمتر از حد نرمال است که ممکن است ناشی از یک دوره طولانی مدت اجتناب از انزال، یا تولید زیاد مایع سمینال باشد. غالبا قسمت ابتدایی انزال حاوی تعداد زیادی اسپرماتوزوئید است و ترشحات وزیکول سمینال که 70 درصد انزال را شامل می شود، قسمت دوم انزال را تشکیل می دهد. اگر فرد فاقد مایع انزالی باشد به آن آسپرمی36 گویند. حجم نمونه را می توان از روی ظروف نمونه گیری توسط کشیدن نمونه به داخل پیپت دهانه گشاد اندازه گیری کرد. چنانچه قرار باشد سیمن در محیط کشت قرار گیرد یا برای لقاح خارج رحمی استفاده شود یا برای مطالعات بیولوژیک بکار رود، باید با ظروف استریل حمل و نقل شود(Hashemi, Karami-Tehrani, & Ghavami, 2004).
1-5-6- غلظت37
یکی از فاکتور های مهم آنالیز سیمن، تعیین تعداد اسپرم در هر میلی لیتر انزال است. غلظت اسپرم ممکن است با استفاده از روش هموسیتومتر یا روش بکارگیری حفره ویژه شمارش اسپرم اندازه گیری شود که روش هموسیتومتر مرسوم تر است. هر چند گستره تعداد اسپرم برای افراد بارور بین 120-60 میلیون در میلی لیتر است، اما طبق معیار WHO، افراد دارای بیش از 20 میلیون اسپرم در هر میلی لیتر را جزء افراد بارور به حساب می آورند. به طور کلی از نظر تعداد اسپرم افراد را به چهار گروه تقسیم می کنند:
1- نرموزوسپرمی38: مایع انزالی دارای تعداد اسپرم طبق استاندارد WHO است(بیشتر از 20 میلیون در هر میلی لیتر انزال).
2- اولیگوزوسپرمی39: مایع انزالی دارای تعداد اسپرم کمتر از استاندارد WHO (کمتر از 20 میلیون در هر میلی لیتر انزال).
3-پلی زوسپرمی40: مایه انزالی دارای اسپرم بالا (بیشتر از 250 میلیون در هر میلی لیتر انزال).
4- آزوسپرمی41: عدم وجود اسپرم در مایع انزالی که می تواند به دلایل زیر باشد:
الف- وجود نقص در مسیر سنتز و ترشح گنادوتروپین
ب- فقدان اسپرماتوژنز در بیضه ها
ج- انسداد مجرا، حالتی که اسپرم فعال تولید می شود اما در بیضه ها محبوس بوده و راهی به خارج ندارد(WHO 2010).

جدول 1-1 : خصوصیات میکرسکوپی نمونه انزال طبیعی مطابق با استاندارد های سازمان بهداشت جهانی (2010/WHO)
خصوصیات مورد نظر مقادیر نرمال
حجم ml2
غلظت اسپرم ml106×20 یا بیشتر
کل تحرک اسپرم 106×40 اسپرم در هر انزال یا بیشتر
تحرک دارای 50 درصد یا بیشتر حرکت (a+b)*


پاسخ دهید